细胞核酶的固定化：

1、概念：使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
2、固定方法：

名称	原理	图示	适用范围
包埋法	将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中		多用于细胞的固定
化学结合法	利用共价链、离子键将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上		多用于酶的固定
物理吸附法	欧诺个过物理吸附作用，把酶固定在纤维素、琼脂糖、多孔玻璃和离子交换树脂等载体上

3、载体：包埋法 固定化细胞常用的是不容于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
4、优点：
（1）固定化酶优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用。
（2）固定化细胞优点：成本更低，操作更容易，可以催化一系列的化学反应。
5、固定化没的反应实例——生产高果糖浆
（1）高果糖浆的生产原理
 
（2）葡萄糖异构酶的固定：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状载体上，装入反应柱中。
（3）高果糖浆的生产操作：（如图）从反应柱上端注入葡萄糖溶液，从下端流出果糖溶液，一个反应拄可连续使用半年。
6、固定化细胞的应用实例——固定化酵母细胞
 

一、实验原理
（1）使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
（2）固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
固定化酶优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用。
固定化细胞优点：成本更低，操作更容易，可以催化一系列的化学反应。

二、实验步骤
（1）细胞的活化
称取1g干酵母，放入50mL的小烧杯中，加人蒸馏水10mL，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化。
【注】活化：让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态
（2）配制物质的量浓度为0.05mo1/L的CaCl₂溶液
   称取无水CaCl₂0.83g。放入200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。
（3）配制海藻酸钠溶液
   称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中。加入10mL水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。
（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的醉母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。
【注】冷却至室温的目的：防止杀死酵母菌
（5）固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl₂溶液中，观察液滴在CaCl₂溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl₂溶液中浸泡30min左右。
【注】CaCl₂溶液的作用：使胶体聚沉
（6）使用固定化酵母细胞发酵
①将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2-3次。
②将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入固定好的
酵母细胞，置于25℃下发酵24h。
三、注意事项
（1）配制海藻酸钠溶液：小火、间断加热、定容，如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。
（2）海藻酸钠溶液与酶母细胞混合：冷却后再混合，注意混合均匀，不要进入气泡
（3）制备固定化酵母细胞：高度适宜，并匀速滴入
（4）刚形成的凝胶珠应在CaCl₂溶液中浸泡一段时间，以便Ca²⁺与Na⁺充分交换，形成的凝胶珠稳定。检验凝胶珠是否形成，可用下列方法：用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果不容易破裂，没有液体流出就表明成功地制成了凝胶珠，还可以用手将凝胶珠在实验桌上用力摔打，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。
（5）凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
四、酶的固定化：
固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。在催化反应中，它以固相状态作用与底物，反应完成后，容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用。酶的催化反应依赖于其活性部分的完整性，因此，在固定某一种酶时必须进行选择适当的条件，使其活性部位的基因团不受影响，如避免高温、强酸、弱碱等条件，以免酶变性失活。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。
物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。
化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。
其中吸附法和共价键法又可统称为载体结合法。

知识点拨：

1、注意事项
（1）配制海藻酸钠溶液：小火、间断加热、定容，如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。
（2）海藻酸钠溶液与酶母细胞混合：冷却后再混合，注意混合均匀，不要进入气泡
（3）制备固定化酵母细胞：高度适宜，并匀速滴入
（4）刚形成的凝胶珠应在CaCl₂溶液中浸泡一段时间，以便Ca²⁺与Na⁺充分交换，形成的凝胶珠稳定。检验凝胶珠是否形成，可用下列方法：用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果不容易破裂，没有液体流出就表明成功地制成了凝胶珠，还可以用手将凝胶珠在实验桌上用力摔打，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。
（5）凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
（6） 海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。例如，加热几分钟后，从石棉网上去下烧杯冷却片刻，并不断搅拌，再将烧杯放回石棉网继续加热，如此重复数次，直至海藻酸钠完全溶化。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。
2、酵母菌活化时体积会变大，因此活化前应选择体积足够大的容器，防止酵母菌细胞的活化液溢出。
3、海藻酸钠溶液的配制是固定化酵母细胞的关键，因为如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠，如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数量少，也会影响实验效果。
4、溶化海藻酸钠时要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊。
 5、将溶化后的海藻酸钠先冷却至室温，再与酵母菌混合，避免高温杀死酵母细胞。

1、理解固定化酶和固定化细胞技术。
2、识记固定化细胞技术的常用方法。
3、识记制备固定化酵母菌细胞过程实验步骤。