高中生物知识点:乳酸脱氢酶同功酶的分离
◎ 乳酸脱氢酶同功酶的分离的定义
乳酸脱氢酶同功酶的分离:

1、乳酸脱氢酶是动物组织中广泛存在的酶,在氧化型辅酶NAD+存在下,它使乳酸脱氢产生丙酮酸。乳酸脱氢酶有许多同工酶。同工酶是指能催化同一化学反应,但其酶蛋白的分子组成不同的一组酶。
本实验的内容是用聚丙烯酰胺电泳法分离LDH的同工酶,用活性染色法呈显同工酶的区带。染色原理是:在LDH的作用下,NAD+被还原为NADH,NADH将电子和H+传递给甲硫吩嗪,还原的甲硫吩嗪再将电子和H+传递给氯化氮蓝四唑,还原的氮蓝四唑呈蓝色,展现在电泳凝胶上。
2、实验:
(1)设备及用品:电泳仪,微量离心管及移液器,大培养皿(直径120mm),烧杯
(2)材料:
①市售牛血清。
②5mg/mLNAD+溶液:称50mgNAD+,溶于10mL蒸馏水中,用棕色瓶在冰箱中保存。
③1mol/L乳酸钠溶液:取60%乳酸钠溶液9.25mL,加蒸馏水至50mL。
④1mg/L甲硫吩嗪(PMS)溶液:称5mgPMS,加蒸馏水5mL,在棕色瓶中使其溶解。
⑤1mg/L氯化氮蓝四唑(NBT)溶液:称20mgNBT,加蒸馏水20mL,在棕色瓶中使其溶解。
⑥0.1mol/L氯化钠溶液:称0.58gNaCl,溶于100mL蒸馏水中。
⑦40%蔗糖溶液(内含少许溴酚蓝):称4g蔗糖加水至10mL,滴加少许1%溴酚蓝至呈明显的蓝色。
⑧电泳用的有关溶液:pH8.9,7.5%系统。
a、凝胶液:丙烯酰胺(Acr)29g与甲叉双丙烯酰胺(Bis)1g,溶于100mL蒸馏水中。
b、pH8.9凝胶缓冲溶液(1.5mol/LTris-HCl缓冲液):取18.1gTris加40mL蒸馏水,用2NHCl调至pH8.9,加蒸馏水至100mL。
c、10%过硫酸铵溶液:取过硫酸铵5g,溶于50mL蒸馏水中,在冰箱中可保存1星期。
d、配置凝胶。
Tris是三羟甲基氨基甲烷。TEMED是四甲基乙二胺,为加速剂。AP为催化剂。

成分

分离胶(下层)

浓缩胶(上层)

蒸馏水

1.65mL

1.40mL

凝胶液

2.0mL

0.33mL

凝胶缓冲液

2.0mL

0.25mL

10%AP

50μL

20μL

TEMED

5μL

5μL

总体积

5mL

2mL

⑨电极缓冲液。50mmol/LTris-甘氨酸缓冲液(pH8.9):取6gTris和3.9甘氨酸加蒸馏水至1L。
3、步骤:
(1)制备电泳凝胶板。组装电泳槽后,依上述方法制备5mL分离胶倒入槽中。在胶的上端轻轻加入少量水,以防止生成胶的弯月面。待胶凝固后,小心倒出蒸馏水,再用滤纸吸净残留的水,拔出梳子。凝胶一定要在倒入前配制。由于电泳槽大小不同,制作和倒入凝胶的量由教师告知。
(2)加样。取10μL血清,加入等体积40%蔗糖溶液,在离心管中混匀后,用移液器吸取15μL样品,小心加到凹槽中,每组一槽,组间进行比较。也可取胎牛、小牛老牛的血清比较同工酶相对百分含量的差别。
(3)电泳。打开电源将电流调至10mA,待样品进入分离胶时,改为20~25mA,当溴酚蓝前沿距下框1~2cm时,将电流调至0,关闭电源。
(4)染色。依下表配制LDH活性染液。(总体积25mL)

贮备液

HAD+

乳酸钠

NaCl

NBT

PMS

Tris凝胶缓冲液

取用量(mL)

4.0

2.5

2.5

10.0

1.0

1.5

3.5
电泳后,取出凝胶板,放在盛有染色液的培养皿中,在37℃水浴上保温20~30min,可看出LDH同工酶呈现蓝紫色区带。
◎ 乳酸脱氢酶同功酶的分离的知识扩展
乳酸脱氢酶是动物组织中广泛存在的酶,在氧化型辅酶NAD+存在下,它使乳酸脱氢产生丙酮酸。乳酸脱氢酶有许多同工酶。同工酶是指能催化同一化学反应,但其酶蛋白的分子组成不同的一组酶。
本实验的内容是用聚丙烯酰胺电泳法分离LDH的同工酶,用活性染色法呈显同工酶的区带。染色原理是:在LDH的作用下,NAD+被还原为NADH,NADH将电子和H+传递给甲硫吩嗪,还原的甲硫吩嗪再将电子和H+传递给氯化氮蓝四唑,还原的氮蓝四唑呈蓝色,展现在电泳凝胶上。
一、设备及用品:电泳仪,微量离心管及移液器,大培养皿(直径120mm),烧杯
二、材料:
(1)市售牛血清。
(2)5mg/mLNAD+溶液:称50mgNAD+,溶于10mL蒸馏水中,用棕色瓶在冰箱中保存。
(3)1mol/L乳酸钠溶液:取60%乳酸钠溶液9.25mL,加蒸馏水至50mL。
(4)1mg/L甲硫吩嗪(PMS)溶液:称5mgPMS,加蒸馏水5mL,在棕色瓶中使其溶解。
(5)1mg/L氯化氮蓝四唑(NBT)溶液:称20mgNBT,加蒸馏水20mL,在棕色瓶中使其溶解。
(6)0.1mol/L氯化钠溶液:称0.58gNaCl,溶于100mL蒸馏水中。
(7)40%蔗糖溶液(内含少许溴酚蓝):称4g蔗糖加水至10mL,滴加少许1%溴酚蓝至呈明显的蓝色。
(8)电泳用的有关溶液:pH8.9,7.5%系统。
①凝胶液:丙烯酰胺(Acr)29g与甲叉双丙烯酰胺(Bis)1g,溶于100mL蒸馏水中。
②pH8.9凝胶缓冲溶液(1.5mol/LTris-HCl缓冲液):取18.1gTris加40mL蒸馏水,用2NHCl调至pH8.9,加蒸馏水至100mL。
③10%过硫酸铵溶液:取过硫酸铵5g,溶于50mL蒸馏水中,在冰箱中可保存1星期。
④配置凝胶。
Tris是三羟甲基氨基甲烷。TEMED是四甲基乙二胺,为加速剂。AP为催化剂。

成分

分离胶(下层)

浓缩胶(上层)

蒸馏水

1.65mL

1.40mL

凝胶液

2.0mL

0.33mL

凝胶缓冲液

2.0mL

0.25mL

10%AP

50μL

20μL

TEMED

5μL

5μL

总体积

5mL

2mL

(9)电极缓冲液。50mmol/LTris-甘氨酸缓冲液(pH8.9):取6gTris和3.9甘氨酸加蒸馏水至1L。
三、步骤:
(1)制备电泳凝胶板。组装电泳槽后,依上述方法制备5mL分离胶倒入槽中。在胶的上端轻轻加入少量水,以防止生成胶的弯月面。待胶凝固后,小心倒出蒸馏水,再用滤纸吸净残留的水,拔出梳子。凝胶一定要在倒入前配制。由于电泳槽大小不同,制作和倒入凝胶的量由教师告知。
(2)加样。取10μL血清,加入等体积40%蔗糖溶液,在离心管中混匀后,用移液器吸取15μL样品,小心加到凹槽中,每组一槽,组间进行比较。也可取胎牛、小牛老牛的血清比较同工酶相对百分含量的差别。
(3)电泳。打开电源将电流调至10mA,待样品进入分离胶时,改为20~25mA,当溴酚蓝前沿距下框1~2cm时,将电流调至0,关闭电源。
(4)染色。依下表配制LDH活性染液。(总体积25mL)

贮备液

HAD+

乳酸钠

NaCl

NBT

PMS

Tris凝胶缓冲液

取用量(mL)

4.0

2.5

2.5

10.0

1.0

1.5

3.5
电泳后,取出凝胶板,放在盛有染色液的培养皿中,在37℃水浴上保温20~30min,可看出LDH同工酶呈现蓝紫色区带。
◎ 乳酸脱氢酶同功酶的分离的考试要求
暂无
◎ 乳酸脱氢酶同功酶的分离的所有试题